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骨髓间充质干细胞如何采集、分离与保存-仟龙医疗
来源: 时间:2021-11-22

骨髓间充质干细胞如何采集、分离与保存

1、收集:用18号穿刺器穿刺术,20ml注射器(含有肝素2000u)在髂前上棘抽取骨髓10ml。抽取骨髓时留意维持针管斜坡在骨髓内。快速抽取骨髓并使其和肝素匀称,避免造成血块。

2、分离纯化:经1200rpm离心10min,吸除顶层脂肪细胞,清洗三次。在骨髓中引入相对密度为1.073Percoll分离出来液。室内温度下3000g离心30min,有核细胞在分页面及顶层液态中,红细胞绝大多数在沉积中。用二倍容积的PBS稀释液,并再度离心。将细胞重悬在少糖10%DMEM FBS细胞培养液中。调节细胞相对密度为1.6*106个/cm2注射于塑造瓶中。37℃,摩尔分数为5%的CO2恒温培养箱中塑造,72d后弃去未贴壁细胞,之后每3天换液一次。当细胞汇聚90%单面细胞后,0.25%蛋白酶室内温度消化吸收传代培养,离心(1000rpm,10min),弃上清,沉积按1:1占比传代培养。

3、储存:搜集生长发育优良的细胞,取小量细胞混液(约0.1ml)记数细胞浓度值及冻前成活率。将细胞添加到含10%DMSO和30%血清蛋白的新鮮培养液中,用无菌检测塑胶冷藏储存管放进到程序流程减温盒中,于-70℃经24h后转到液态氮储存。30d后,恢复细胞,用椎虫蓝上色检验细胞活力,于37℃、摩尔分数为5%的CO2恒温箱中塑造,每日颠倒显微镜下观查细胞生长发育状况(细胞生长发育情况及总数)。关键观查指标值:1)人骨髓间充质干细胞的生长曲线图剖析;2)细胞制冷机组恢复生长发育特点剖析。

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